新型CRISPR方法鉴定了弓形虫存活的关键基因

使用一种新方法对CRISPR进行遗传筛查，克里克的研究人员已经确定了小鼠寄生虫弓形虫存活的关键基因。

他们在Nature Communications上发表的新方法提供了一种灵活的新方法，可以扩展CRISPR 筛查的使用范围。该方法还允许同时测试小鼠中数百种寄生虫的基因，从而大大减少了所用研究动物的数量。

CRISPR筛选是鉴定基因功能的极其有效的方法。使用指导RNA(称为gRNA)，特定基因被靶向并被“敲除”。这种消除有助于确定哪些基因对于细胞存活至关重要。然而，这些筛选通常在全基因组中进行，并且这种规模可以限制人们可以做的实验类型。

为了克服全基因组筛选的局限性，该团队开发了一种新方法，使用单步克隆方法快速生成和分析不同大小和组成的定制CRISPR文库。该研究由Apicomplexan Parasites实验室的Signaling领导，与生物信息学和高通量筛选设施的成员合作。

“这种创建和分析仅靶向基因子集的gRNA库的方法使我们能够更快地执行CRISPR筛选并将其转移到体内感染模型中，”该论文的高级作者克里克组织负责人Moritz Treeck说。

“从靶阵列中选择靶向感兴趣基因的gRNA，然后将其克隆并组装成合并的CRISPR文库。然后将该定制的CRISPR文库转染到寄生虫中以产生突变体库，然后在小鼠或细胞培养物中培养。对输入和输出突变体库进行测序，我们能够识别那些对任何选择条件下的生长都很重要的基因。“

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种影响大约三分之一人口的寄生虫。虽然在健康个体中也有与感染相关的一些症状，寄生虫是艾滋病患者，子宫儿童发育构成严重威胁毒株引起的眼部疾病在南美盛行。以前，全基因组遗传筛选已用于体外鉴定细胞培养中生长所需的基因，但筛选方法可鉴定那些对调节宿主免疫反应和确保体内存活至关重要的基因，称为“毒力因子” ，“还没有。

“通过选择一个基因子集来定位，我们没有在寄生虫能够繁殖之前冒着压倒宿主的风险，”克里克的博士后和该论文的共同主要作者乔安娜杨说。“我们用弓形虫突变体池感染小鼠，我们预测它们会与宿主发生相互作用。这揭示了新的毒力因子，并证实了以前工作中已知的那些。”

有趣的是，研究小组还发现，一些无法自行生存的菌株在混合池中共同感染时是成功的。

“例如，MYR1基因是许多弓形虫分泌蛋白功能所必需的，没有它，寄生虫就无法感染，”乔安娜解释道。“但我们惊讶地发现MYR1敲除仍然存在，并且当它们与其他突变体一起被感染时能够在小鼠中存活。现在我们需要找出这种情况如何发生!”

下一阶段已在进行中。该团队将与Advanced Sequencing工具合作，以识别单个CRISPR突变体和受感染宿主细胞的完整RNA，以确定特异性干扰宿主反应的毒力因子。

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