生产和筛选工程化抗微生物肽的高通量方法

大自然为我们提供了大量的抗菌药物。然而，鉴于抗微生物剂抗性的快速增加，需要开发新的天然抗生素。Lantibiotics是一个有趣的选择。来自格罗宁根大学的分子生物学家及其在瑞士和德国的同事现已开发出一条管道，用于创建和筛选大量新的羊毛硫抗生素肽。该方法的描述和第一批结果于4月1日在Nature Chemical Biology期刊上发表。

抗生素肽在被核糖体产生后被修饰。酶可以连接肽链内的不同氨基酸以形成环。众所周知的羊毛硫抗生素是乳链菌肽，一种具有五个环的肽，用作食品工业中的防腐剂。“构成环的氨基酸序列不同，”格罗宁根大学分子生物学教授Oscar Kuipers解释说。“我们知道，12种天然羊毛硫抗生素的选择都有不同的组合。”

合成基因来自苏黎世联邦理工学院(瑞士)和雷根斯堡大学(德国)的Kuipers和他的同事设计了一个系统来创造大量新的羊毛硫抗生素：'我们合成了编码不同环的DNA链，并将这些遗传模块组合起来形成编码的羊毛硫抗生素基因五个戒指的随机组合。'他们创建的基因库包含大约14,000个合成基因。

下一步是筛选基因产物的抗菌潜力。为此，他们修改了一种基于微藻酸盐珠子的酶筛选技术。在这些珠子内部 - 每个直径约70微米 - 细菌可以生长。将来自文库的基因放入含有红色荧光标记的生产菌株中。'我们稀释这些细菌，以便每个珠子最终得到一个或零个细胞。我们还添加了可被羊毛硫抗生素杀死的目标菌株;这些细胞的使用浓度更高，每个珠子约50个。靶细胞携带绿色荧光标记物并产生肽酶，其激活由生产细胞分泌的前体羊毛硫抗生素。

筛选当珠子孵育时，生产菌株在里面形成单个菌落，分泌羊毛硫抗生素。这些肽不能留下珠子。在每个珠子内生长的绿色菌落的数量与活化的多肽的抗微生物效果负相关。使用针对颗粒设计的荧光辅助细胞分选仪，可以每小时筛选50,000个珠子并选择具有低水平绿色荧光的珠子。

但这次筛选绝不是需要完成的工作的结束。下一步是从选择的珠子中分离出生物菌落，这些珠子显示出强烈的抗菌作用。这很简单;然而，由于珠内的生产水平低，所形成的产品的确切表征变得困难。“在我们分析生产的羊毛硫抗生素之前，我们首先必须大量种植它们。”另一个复杂因素是产生环的酶不能以完美的准确度起作用。“即使在一个集落中，所有细胞都具有相同的DNA，也可以产生多达五六种不同的长肽。”

理性设计该研究的第二个结论是，从生成基因库到筛选和表征的管道非常有效。下一步是使用真正的病原体作为报告菌株，而不是第一轮使用的乳球菌细胞。'我们现在正在努力用一个环来制造多肽。我们在这项研究中生产的五环肽对于药物来说太大了。许多抗生素类似于单环结构，类似于万古霉素。这些抗生素是通过氨基酸的特异性酶促连接制备的，而羊毛硫抗生素是通过核糖体从基因产生的。“这意味着我们可以使用快速分子生物学技术来创建和筛选大型图书馆。”

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